Determinacion de proteinas

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PRACTICA 2 Determinación de proteínas totales por el método de Biuret.

1 INTRODUCCIÓN

La mayoría de proteínas plasmáticas se sintetizan en el hígado, exceptuando a las inmunoglobulinas que se forman en las células plasmáticas del bazo, los nódulos linfáticos y la médula ósea.
Las dos causas generales de alteraciones de la proteína total sérica son cambios de volumen de agua plasmática ycambios en la concentración de una o varias proteínas séricas.
La hiperproteinemia puede ser debida a deshidratación (aporte insuficiente de agua, vómitos o diarreas severos, enfermedad de Addison, cetoacidosis diabética) o a un aumento en la concentración de proteínas específicas (inmunoglobulinas en infecciones, mieloma múltiple). La hipoproteinemia se puede producir a causa de una hemodilución(síndromes de retención salina y las infusión intravenosa masiva), por un defecto en la síntesis proteica (malnutrición severa, enfermedad hepática crónica, malabsorción intestinal) o por pérdidas excesivas debidas a enfermedad renal crónica o quemaduras severas1,2.
El diagnóstico clínico no debe realizarse teniendo en cuenta el resultado de un único ensayo, sino que debe integrar los datosclínicos y de laboratorio.

2 OBJETIVOS

Determinar la concentración de proteínas totales en una muestra de suero utilizando el método de Biuret.

3 FUNDAMENTO

Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. Muchos de estos métodos se basan en:
a) La propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV.
b) Para la formación de derivados químicos.
c) La capacidadque tienen las proteínas de unir ciertos colorantes.
Dentro de los métodos derivados colorimétricos se encuentra el de Biuret, el cual se basa en la
formación de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptídicos en medio
alcalino. Un ion Cu2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlacespeptídicos) y la reacción es bastante específica, de manera que pocas
sustancias interfieren. La sensibilidad del método es muy baja y sólo se recomienda para la
cuantificación de proteínas en preparados muy concentrados (por ejemplo en suero).
El método descrito está basado en los reportes de Weischselbaum3 y Gornal et al4. El color violeta
desarrollado es directamente proporcional al número de enlacespeptídicos de las proteínas e
independiente de la concentración relativa de albúmina y globulina5.

4 PROCEDIMIENTO

A EQUIPO, MATERIAL Y REACTIVOS NECESARIOS MATERIAL DE APOYO

Material común de laboratorio.

REACTIVOS:
Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado
analítico, cuando se indique agua, debe entenderse agua destilada.
− Reactivo de Biuret (líquido):Solución de Sulfato de Cobre
pentahidratado 0.3 g/dL, en solución de Hidroxido de Sodio
0.8 g/dL. También contiene Ioduro de Potasio y Tartrato de
Sodio y Potasio.
− Alcohol etílico.
− Agua destilada.

MATERIALES:

− Tubos primarios al vacío para toma múltiple con gel
separador.
− Torundas.
− Torniquete.
− Agujas para extracción sanguínea múltiple.
− Tubos de ensaye de 13X100.
− Pipetaautomática de 10-100 μL.
− Pipeta automática de 100-1000 μL.
− Puntas amarillas para pipeta automática.
− Puntas azules para pipeta automática.
− Celdas para espectrofotómetro.

MATERIAL BIOLÓGICO:

− Suero sanguíneo humano.
− Suero control de origen humano de concentración “normal”.
− Suero control de origen humano de concentración
“patológica”.
− Solución acuosa de Albúmina BovinaFracción V (10 g/dL),
con azida de sodio como conservador.

APARATOS E INSTRUMENTOS

Los aparatos que a continuación se indican deben estar
calibrados y ser ajustados antes de su operación:
− Espectrofotómetro.
− Centrifuga.

B DESARROLLO DE LA PRÁCTICA
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA.
1. Extracción de una muestra de sangre venosa.

a. Realizar la extracción de una muestra de sangre total...
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