Determinación De La Constante De Eq. Mioglobina

20122013

Práctica 4.TERMODINÁMICA Y CINÉTICA QUÍMICA Procesos de reconocimiento molecular en sistemas biológicos: determinación de la constante de equilibrio correspondiente a la unión de un ligando a una proteína.



Grado en Biotecnología 2012-2013

Práctica 4.Proceso de reconocimiento molecular en sistemas biológicos: determinación de la constante de equilibrio correspondiente a launión de un ligando a una proteína.
Objetivos

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Determinar la constante de equilibrio de la unión de la azida, a la proteína mioglobina,Mb, a partir de los cambio espectrales que se observan como consecuencia de la formación del complejo Mb· . Entender la relación existente entre los cambios espectrales incluidos por la formación del complejo y el desplazamiento del equilibrio químicoinducido por el aumento de concentración del ligando.

Material

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Espectofotómetro Zuzi Mod.4201/20 1 bureta ( cada 3 grupos) Disolución de mioglobina 8 M 1 vaso de precipitados de 100ml 10 tubos de ensayo de 12 ml Gradilla para los tubos

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Cubetas de plástico de 3,5 ml Disolución de tampón borato 50 mM,pH 9,0 Disolución azida sódica, 10mM Disolución azida sódica,0,1mM Disolución azida sódica, 0,8mM

Ejecución de la práctica
1.- Determinación del coeficiente de extinción de la hemoglobina a 409
nm.
Dispondremos de dos buretas una con mioglobina, Mb, con una concentración 8µM y otra que contendrá una disolución tampón ( diluyente:50 mM de borato a pH 9,0). Utilizando cinco tubos de ensayo prepararemos las siguientes disoluciones que contendrán losvolúmenes que se indican en la siguiente tabla. Posteriormente mediremos y anotaremos la absorbancia de cada disolución a 409 nm, empleando para ello una cubeta de 1 cm de paso óptico. Tubo nº Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 1,0 3,0 5,0 7,0 9,0 9,0 7,0 5,0 3,0 1,0 2,4 4 5,6 7,2 [Mb]/M 0,166 0,445 0,763 1,101 1,428

Cuestiones del apartado 1 1.1.- Calcula el coeficiente de extinción de la mioglobinaa 409 nm. Representamos en una gráfica la absorbancia frente a la concentración de la proteína. De acuerdo con la Ley de Lambert-Beer, la pendiente de la recta es igual al coeficiente de extinción de la proteína: .

Cálculo coeficiente de extinción

1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0,00E+00 1,00E-06 2,00E-06 3,00E-06 4,00E-06 5,00E-06 6,00E-06 7,00E-06 8,00E-06 [Mb]/M

y = 198750x - 0,0144R² = 0,9988

1.2.-Discute cuáles son, en tu opinión, las fuentes de error más importantes que afectarían al coeficiente de extinción determinado experimentalmente. El coeficiente de extinción depende tanto de la concentración de mioglobina como de la absorbancia de ésta a 409 nm. Los posibles errores cometidos a la hora de preparar las disoluciones como no medir los volúmenes correctos demioglobina y tampón provocarán cambios en la concentración final de mioglobina en los 10ml de disolución. Así mismo, errores cometidos a la hora de medir la abosrbancia como podrían ser: coger la cubeta por la parte inferior a la hora de colocarla en el espectrofotómetro o no lavarla bien la cubeta entre medidas de las distintas disoluciones y quedar ésta contaminada, pueden afectar al cálculo final delcoeficiente de extinción.

2.- Determinación de la constante de equilibrio de la formación del complejo Mb· .
Para la realización de esta parte de la práctica dispondremos de cinco buretas, dos que contendrán mioglobina y disolución tampón, a la misma concentración que el apartado anterior, y otras tres que contendrán disoluciones de de concentración 0,1mM, 0,8mM y 10mM respectivamente.Utilizando ocho tubos de ensayo prepararemos disoluciones que contendrán las volúmenes indicados en la tabla siguiente. a) Utilizando la bureta cuya concentración de azida es 0,1 mM:

Abs 409 nm

Tubo nº Tubo 0 Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 4,0 2,5 0,5 0,0 1,0 2,5 4,5

[Mb]/M 4 4 4 4

[

]/M 0,0

1 2,5 4,5

b) Utilizando la bureta cuya concentración de azida es 0,8 mM: Tubo...