Hibridacion insitu

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA PROGRAMA DE POSGRADO EN CIENCIAS BIOQUÍMICAS

EVALUACIÓN FINAL CURSO DE MÉTODOS

COORDINADOR DEL CURSO: DR. ROBERTO STOCK

ALUMNA: BLANCA RAMOS CERRILLO

TEMA:HIBRIDACIÓN in situ

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ÍNDICE I. Introducción II. Breve historia III. Pasos y consideraciones de la hibridación in situ IV. Preparación de la sonda a) Diseñode sondas b) Tipo de sonda y método de síntesis c) Elección de la sonda d) Tamaño de la sonda e) Estabilidad de la sonda f) Sondas de doble cadena contra las de cadena sencilla V. Marcaje a) (3H) Tritio b) 35S c) 32P d) 33P e) Marcaje con digoxigenina f) Marcaje con biotina g) Marcaje fluorescente de ácidos nucléicos h) Métodos de marcaje para: i) DNA ii) RNA iii) Oligonucleótidos VI. Preparaciónde tejidos a) Fijación b) Tejido embebido y su seccionamiento VII. Tratamiento de la laminilla VIII. Pretratamiento del tejido a) Tratamiento con solventes orgánicos b) Tratamiento con proteasas para facilitar la accesibilidad al RNA de interés c) Inactivación endógena enzimática d) Tratamiento con RNasas e) Tratamiento con HCL f) Tratamiento con detergentes 1 1 2 4 5 5 6 6 7 7 7 7 8 8 8 8 9 11 1213 13 14 14 15 15 16 16 16 17 17 17 17

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g) Impedimento de enlaces h) Pre-hibridación i) Blancos del DNA IX. Pre-hibridación y desnaturalización de la sonda y su blanco X. Hibridación a) Largo de la sonda b) Composición de la sonda c) Identidad d) Composición de la solución de lavados de la hibridación e) Desnaturalización del DNA f) pH g) Temperatura XI. Lavados post-hibridación XII.Detección a) Sondas radioactivas i) Grados de la emulsión ii) Espesor de la emulsión iii) Almacenamiento y vida media de la emulsión iv) Condiciones de exposición v) Tiempo de exposición vi) Condiciones para revelarla b) Sondas marcadas con haptenos XIII. Técnicas de doble tinción XIV. Controles a) Hibridación cruzada con secuencias de ácidos nucléicos inespecíficos b) Enlaces inespecíficos c)Generación inespecífica de la señal d) Ruido de fondo sobre tejidos específicos e) Ruido de fondo de sondas marcadas con haptenos XV. Fotografía XVI. Microscopía a) De campo claro b) De campo oscuro c) De contraste de fases d) Microscopía de contraste de reflexión e) De fluorescencia

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f)Imágenes digitales g) Microscopía electrónica h) Flujo citométrico XVII. Algunas otra técnicas: PRINS a) Principios y métodos de in situ PCR b) Amplificación in situ c) Detección de productos de PCR en la célula d) Eficiencia de PCR in situ e) PCR in situ tiene una gran número de aplicaciones en diagnóstico f) Controles para PCR in situ XIX. Comparación de las técnicas de hibridación in situ

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Abreviaturas A AP BCIP Bio BrdU C cDNA DAB DAPI DEPC DIG DMSO DNasa dsDNA DTT EDTA FISH FITC FLU G mRNA NTB PBS PCR PFA RNasa snRNA snoRNA ssDNA STS T TBE TBS TE TEMED TESPA Tm Tr tRNA U UV

Adenina Fosfatasa alcalina 5-bromo-4cloro-3-indolil fosfato biotina 5-bromo-4-cloro-3-indolid fosfato citosina DNA complementario diaminobenzidina4’,6-diamino-2-fenilindole dietilpirocarbonato digoxigenina dimetilsufóxido deoxiribonucleasa doble cadena de DNA ditiotreitol ácido etilenoadiaminotretacético fluorescence in situ hybridization Fluorescencia in situ Fluoresceína Guanina mRNA 4-nitroblue-tretrazolium chloride buffer fosfato salino reacción en cadena de la polimerasa paraformaldheído ribonucleasa small nuclear RNA small nucleolar RNA cadena sencilla deDNA sitio de pegado de la secuencia timina tris-borato-EDTA tris buffer salino tris-EDTA tetrametilenediamina 3-aminopropiltrietoxisilina Temperatura de fusión Temperatura de reasociaión RNA de transferencia uracilo luz ultravioleta

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Índice de tablas y figuras Pág. Figura 1. Principios de la hibridación in situ Figura 2. Diagrama de flujo de la hibridación in situ Figura 3. Estructura...