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El Western blot, o inmunoblot, es una técnica analítica usada para detectar proteínas específicas en una muestra determinada (una mezcla compleja de proteínas, como un extracto tisular). Mediante una electroforesis en gel se separan las proteínas atendiendo al criterio que se desee: peso molecular, estructura, hidrofobicidad, etc. Hay casi tantas posibilidades como tipos de electroforesisexisten. Luego son transferidas a una membrana adsorbente (típicamente de nitrocelulosa o de PVDF) para poder buscar la proteína de interés con anticuerpos específicos contra ella.1 2 Finalmente, se detecta la unión antígeno-anticuerpo por actividad enzimática, fluorescencia entre otros métodos. De esta forma se puede estudiar la presencia de la proteína en el extracto y analizar su cantidad relativarespecto a otras proteínas.

Esta técnica es hoy en día imprescindible en varios campos de la biología, como la biología molecular, la bioquímica, la biotecnología o la inmunología. Existe toda una industria especializada en la venta de anticuerpos (monoclonales y policlonales) contra decenas de miles de proteínas diferentes.3 4

El Western blot fue desarrollado en el laboratorio de George Stark,en la Universidad de Stanford.2 El nombre (Western, occidental en inglés) le fue dado por W. Neal Burnette,5 y consiste en un juego de palabras con una técnica análoga pero que usa DNA, el Southern (sureño) blot, que en este caso debe su nombre a su descubridor, Edwin Southern. Otras técnicas que fueron nombradas siguiendo este criterio son el Northern blot (en el que se separa e identifica RNA),el Eastern blot, el Southwestern blot.



Índice [ocultar]
1 Pasos del Western blot
1.1 Preparación de la muestra
1.2 Electroforesis en gel
1.3 Transferencia
1.3.1 Difusión simple
1.3.2 Transferencia al vacío
1.3.3 Electrotransferencia
1.4 Bloqueo
1.5 Detección
1.5.1 Método en dos pasos
1.5.1.1 Anticuerpo primario
1.5.1.2 Anticuerpo secundario
1.5.1.2.1 Radiactividad
1.5.1.2.2Anticuerpo unido a una enzima
1.5.1.2.3 Marcaje fluorescente
1.5.1.2.4 Sistema avidina/estreptavidina
1.5.1.2.5 Detección con oro
1.5.2 Método en un paso
1.6 Análisis
1.6.1 Detección colorimétrica
1.6.2 Detección quimioluminiscente
1.6.3 Detección radioactiva
1.6.4 Detección fluorescente
1.7 Exploraciones secundarias
2 Aplicaciones
2.1 Investigación
2.2 Diagnóstico
3 Protocolos
4Véase también
5 Enlaces externos
6 Referencias
Pasos del Western blot[editar]
Preparación de la muestra[editar]
Las muestras pueden ser tomadas de un tejido entero o de un cultivo celular:

Una pequeña cantidad del tejido se introduce en un buffer de extracción. Después se procede a homogeneizarlos, sea con una licuadora (para grandes volúmenes de muestra), con un homogenizador (para muestraspequeñas) o por sonicación. Por último se centrifuga para obtener las proteínas en el sobrenadante, la fracción no precipitada.6
Las células pueden lisarse por uno de esos métodos mecánicos. También pueden usarse detergentes, sales o tampones que favorezcan la lisis y solubilicen las proteínas. A veces se añaden inhibidores de proteasas y fosfatasas que evitan la digestión por las enzimascelulares de las proteínas y de las fosfoproteínas, respectivamente.7
Los materiales deben estar a bajas temperaturas (~4 °C) para evitar la desnaturalización proteica. Para separar proteínas de compartimentos y orgánulos celulares es preciso combinar técnicas mecánicas - como filtraciones y centrifugaciones - y bioquímicas.

SDS-PAGE sample.png
Electroforesis en gel[editar]
Artículo principal:Electroforesis en gel
Las proteínas de la muestra serán separadas mediante una electroforesis en gel en función de uno o varios (en las electroforesis bidimensionales) de estos criterios: punto isoeléctrico, peso molecular y carga eléctrica. La naturaleza de la separación depende del tratamiento de la muestra y de la naturaleza del gel.

La electroforesis en gel más frecuente, conocida como...