Obtención del piruvato por fermentación de glucosa”

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  • Publicado : 18 de septiembre de 2010
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PRÁCTICA 1
“OBTENCIÓN DEL PIRUVATO POR FERMENTACIÓN DE GLUCOSA”
Objetivo:
El alumno comprenderá y demostrará la producción de uno de sus intermediarios metabólicos: el piruvato, el cuel será identificado a través de reacciones coloridas
Fundamento:
DEMOSTRACIÓN DE INTERMEDIARIOS METABOLICOS.
Los metabolitos: piruvato y acetaldehído, se encuentra presentes normalmente en muy bajasconcentraciones; por lo tanto para demostrar su existencia como intermediarios en el camino metabólico, es necesario impedir que sean transformaciones en otros compuestos.
Este procedimiento se usa mucho cuando se investigan rutas metabólicas y se hace: bloqueando la enzima que cataliza la conversión del compuesto que se está investigando mediante inhibidores. También se pueden cambiar las condicionesfisiológicas para que la enzima funcione a una velocidad muy por debajo de su actividad máxima, o se puede usar un agente que “atrape” el intermediario y que forme un compuesto que no puede metabolizarse.
Para la realización de esta práctica es necesario detener el proceso de degradación en el piruvato mediante reacciones coloridas
Material:
 10 tubos de ensayo
 2 matraces Erlenmeyer de 250ml
 Tapones de hule
 2 matraces volumétricos de 250 ml
 2 pipetas graduadas de 10 y 5 ml
 1 tina galvanizada
 Gradilla metálica
Equipo:
 1 termómetro
 1 parrilla eléctrica con agitador magnético
 1 balanza granataria
 1 centrifuga

Material Biológico
 20 g de levadura para pan (sacharomyces cereviseae)
Reactivos:
 Fosfato dibásico de sodio 0.5 M (Solución A)
 Fosfatomonobásico de potasio 0.5 M (Solución B)
 Suspensión de levadura al 10% en la solución A
 Suspensión de levadura al 10% en la solución B
 Solución de nitroprusiato de sodio al 5%
 Hidróxido de amonio concentrado
 Sulfato de amonio sólido
 Solución de glucosa al 10%
 Hidróxido de sodio al 10%
 Solución de 2,4 dinitrofenilhidrazina al 0.1% en HCl 2N
 Ácido tricloroacético al 10%(TCA)
 Ácido piruvico (sal sódica)
 Agua destilada c. b. p
Nota: Para la preparación de las sustancias de la levadura en las soluciones de fosfato, se recomienda dispersarla en la mayor cantidad de solución (aproximadamente 15 ml) y posteriormente hacer el aforo al volumen correspondiente
DETERMINACIÓN DE PIRUVATO USANDO NITROPRUSIATO DE SODIO:
1. Hervir los sobrenadantes por tres minutos enbaño maría
2. En un tubo de ensayo agregar 2 ml del sobrenadante sobre 1 g de sulfato de amonio sólido
3. Agregar 2 gotas de solución de Nitroprusiato de sodio al 5%
4. Mezclar vigorosamente y dejar deslizar con cuidado por las paredes del tubo, hidróxido de amonio concentrado hasta que se formen dos capas

Si hay piruvato se forma un anillo verde o azul en la interfase de los dos líquidos. Laformación de un anillo rosado transitorio en la interfase indica la presencia de grupos tioles, esto se observa con frecuencia antes de la formación del anillo azul.
DETERMINACIÓN DE PIRUVATO CON 2,4 DINITROFENILHIDRAZINA COMO PRUEBA CUANTITATIVA
1. Agregar 1 ml de solución saturada de 2,4 dinitrofenilhidrazina a 2 ml de sobrenadante
2. Mezclar fuertemente y colocar 2 ó 3 gotas de ésta mezcla enotro tubo de ensaye
3. Agregar 1ml, de solución saturada de 2,4 dinitrofenilhidrazina a 2ml, de sobrenadante.
4. Mezclar fuertemente y colocar 2 ó 3 gotas de ésta mezcla en otro tubo de ensaye.
5. Agregar 1 ml de solución de hidróxido de sodio al 10% y diluir hasta 5 ml con agua destilada. La formación de un color rojo indica la presencia de piruvato

Curva comparativa de piruvato de sodioPreparación de las soluciones
• Solución stock de piruvato de sodio 10 g%: Pesar 1g. de piruvato de sodio y afore a 100 ml con agua destilada.
• Solución de piruvato de sodio 0.5 g%: Tomar 5 ml de la solución stock y aforar a 100 ml con agua destilada
• Solución de piruvato de sodio 1 g%: Tomar 10 ml de la solución stock y aforar a 100 con agua destilada.
• Solución de piruvato de sodio...
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