PRACTICA 1 GELES DE POLIACRILAMIDA Recuperado


Electroforesis en geles de poliacrilamida
Separación de proteínas



Bioquímica



ÍNDICE
OBJETIVO 2
INTRODUCCIÓN 2
DESARROLLO EXPERIMENTAL 3
A) REACTIVOS 3
B) MATERIALES 3
C) PROCEDIMIENTO DE MEDIDA 3
I. PREPARACIÓN DEL GEL DE POLIACRILAMIDA 3
II. CARGADO DE MUESTRAS Y SIMULACIÓN DE ELECTROFORESIS 5
ANALISIS DE RESULTADOS 6
A) CUESTIONES 7
CUESTIONES DE LA PARTE EXPERIMENTAL 8
CONCLUSIÓN 10BIBLIOGRAFÍA 10


OBJETIVO
El objetivo de este ensayo es preparar el gel de poliacrilamida y observar el procedimiento necesario para la realización de electroforesis de proteínas. A continuación, se realiza una ejemplificación de cómo se introduce la muestra en el gel, aunque se empleará un colorante en lugar de una muestra con proteínas.
Este ensayo no incluirá la parte electroforéticaINTRODUCCIÓN
   La electroforesis es un método de laboratorio de separación de moléculas, que poseen una carga neta al aplicar una corriente eléctrica controlada. En función de la carga de la molécula se desplazarán al electrodo de carga contraria, a una mayor velocidad (mayor carga, mayor velocidad). De esta forma, se consigue, a unas condiciones concretas, se consigue la electroforesis de distintasmoléculas de una misma matriz, y que serán diferentes en su separación y comportamiento debido a la diferente movilidad de cada una de ellas.
La electroforesis en gel es una técnica muy utilizada con las proteínas y los ácidos nucleicos. Consiste en colocar un gel que contenga la solución amortiguadora adecuada a modo de lámina entre dos placas de cristal.
Los materiales más corrientes son lapoliacrilamida (un polímero entrecruzado soluble en agua), y la agarosa (un polisacárido).
Entre las diversas técnicas de electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE, por sus siglas en inglés “polyacrylamide gel electrophoresis”), probablemente, la técnica más utilizada es la SDS – PAGE, tanto para analizar mezclas de proteínas, como para ser combinada con técnicas de inmunoelectrotransferencia. En estatécnica, se mezclan las proteínas con el detergente aniónico SDS para formar complejos desnaturalizados, cargados negativamente. La cantidad de SDS unido a las proteínas es proporcional a su tamaño; de esta manera se forma un complejo SDS-proteína donde la carga inicial de la proteína queda enmascarada. De tal manera que su separación depende únicamente de su peso molecular.
El gel se va acaracterizar por ser: químicamente inerte, transparente y estable a amplios rangos de pH, temperatura y fuerza iónica.
La separación de proteínas por estos geles dependerá de la porosidad, que está determinada por la proporción relativa de poliacralamida y bis-acrilamida; para tener un tamaño de poro pequeño se necesitará un mayor porcentaje de la proporción. Que el gel tenga un menor tamaño de poro hace quela separación de proteínas de menor tamaño sea más eficaz.
La separación de proteínas está basada en la carga neta que presentan a pH diferentes de sus puntos isoeléctricos, de forma que pueden desplazarse en un campo eléctrico. La velocidad de migración es proporcional a la relación entre las cargas de la proteína y su masa. Por ello, esta técnica es útil para estimar el peso molecular de unaproteína
La determinación del peso molecular de una proteína se realiza basándose en la curva de calibrado mediante la migración de patrones de peso molecular conocido, teniendo en cuenta que la movilidad electroforética relativa (Rf) es inversamente proporcional al logaritmo del peso molecular. El margen de error que se usaran en este procedimiento de estimación será ±10%

DESARROLLOEXPERIMENTAL
A) REACTIVOS
Solución acrilamida/bis – acrilamida (30%)
Amortiguador del gel separador (18.95 g Tris + 100 ml H2O + HCl, pH = 8.8)
Amortiguador del gel compactador (superior o stacking) (3 g Tris + 100 ml H2O + HCl, pH = 6.8)
Persulfato amónico 10%
Solución SDS 10 %
TEMED
Agua ionizada
Amortiguador de cámara
Colorante azul
B) MATERIALES
Cubeta de electroforesis con cristales, peine y...