Practica de fotocolorimetría




Primer informe de laboratorio de bioquímica

Práctica No. 1 Espectro de absorción y curva de calibración mediante fotocolorimetría



Juan Manuel Posso Gómez, Andrés José Villa

Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Ciencias, Programa Ingeniería biológica


Resumen

En la química se emplean los métodos ópticos para hallar concentraciones, estos son las técnicasespectroscópicas basadas en las radiaciones emitidas desde el espectro ultravioleta, visible e infrarrojo. En una forma general en la espectroscopia una muestra problema es estimulada al aplicar energía, en el caso de la práctica se aplicara luz a la muestra que inicialmente está en un estado fundamental o basal y la meta es alterar este estado excitando los electrones para que lleguen a orbitales demayor energía y así obtener información de la muestra midiendo la energía electromagnética emitida conforme regresa a su estado fundamental. Por esta razón la fotocolorimetría es una rama de la espectroscopía.

En la práctica la finalidad es encontrar concentraciones de una solución de albúmina incolora mediante técnicas de coloramiento con reactivo de Biuret para que la proteína no deje pasar losrayos de luz y medir la absorbancia de la muestra en distintas longitudes de onda y comparar la concentración con la absorción de esta muestra.

Al medir la absorbancia de la muestra se encontró que la longitud de onda que más absorbe la sustancia coloreada es a los 540 nm, por lo que a esta longitud se midieron distintas concentraciones de una solución patrón para graficar la curva decalibración y hallar la concentración final de una solución desconocida que fue 0,335% p/v.

Al final se concluyó que el % de error en la concentración de la muestra fue de 66,42% por lo que se determinaron los motivos del error.

Palabras clave: Blanco. Espectro electromagnético. Transición electrónica. Coloración. Reactivo de Biuret.



Introducción
La fotocolorimetría es un método utilizadopara hallar concentraciones de ciertas muestras, esto se hace midiendo la intensidad de la luz absorbida o transmitida por una sustancia coloreada. Pero el método no se limita solo a las sustancias coloreadas como se pueden observar en esta prueba; la albúmina es una sustancia incolora, al hacerla reaccionar con ciertas especies que generan un producto coloreado se puede hallar su absorbanciarestando la de los demás compuestos por medio de un blanco.
Es importante saber que las sustancias son coloreadas cuando absorben y transmiten radiación en una longitud de onda desde 380 a 780 nm además el color observado son las longitudes de onda no absorbidas. Para calcular la absorbancia de una sustancia se trabaja con el fotocolorímetro en una frecuencia de luz específica.
En la práctica sepretende con los principios básicos de la fotocolorimetría determinar el espectro de absorción de un compuesto y determinar concentraciones desconocidas de muestra de proteína; para esto es necesario determinar una gráfica en la cual el compuesto absorbe mayor intensidad la energía, a esta gráfica se le llama espectro de absorción.
La intensidad de energía absorbida depende del número de moléculasque sufren la transición a la longitud de onda seleccionada, pero a su vez el número de moléculas depende de la concentración, por esto se quiere encontrar dichas concentraciones aplicando la ley de Beer que es A=Ԑ*c*l, donde A es la absorción, Ԑ es el coeficiente de extinción molar y l es la longitud de la celda en cm.
Materiales y métodos
-Reactivos:
Fotocolorímetro, reactivo de Biuret,solución patrón de albúmina 3 mg/ml (Esta debe obtenerse a partir de una solución patrón de BSA), solución salina al 0,85%, muestras problema: caseína, suero sanguíneo, gelatina sin sabor.
-Procedimiento:
1. DETERMINACIÓN DEL ESPECTRO DE ABSORCIÓN DE LA ALBÚMINA.
1.1 En un tubo de ensayo adicionar 1 ml de solución patrón de albúmina a concentración de 3 mg/ml, 4 ml del reactivo de Biuret y 1 ml...