Proteinas

DETERMINACION DE PROTEINAS POR EL METODO DE LOWRY Y BRADFORD.
OBJETIVOS.
* Elaborar una curva de calibración para la cuantificación de proteínas empleado un método fotométrico.
* Determinar si hay una diferencia estadística significativa en la precisión y la exactitud entre los métodos de Bradforfd y Lowry.
* Determinar el efecto de algunas sustancias no proteicas, que puedaninterferir en el método.
* Analizar las ventajas y desventajas del método de Lowry y Bradforfd, con respecto a otros métodos para la cuantificación de proteínas.
FUNDAMENTOS.
Los métodos directos de cuantificación de la proteína se basan en algunas características propias de las estructuras proteicas, como la capacidad de reducir determinados iones, propiedades del enlace pepitico o el contenido dealgún aminoácido en particular; a partir de estos datos se puede deducir la cantidad total de proteínas que se presenta en la muestra. Entre estas técnicas colorimétricas diseñadas para este fin se encuentra: el método de Lowry basado en la cuantificación de los grupos fenólicos que permiten valorar el aminoácido tirosina, único aminoácido fenólico el método de Bradford que cuantifica losaminoácidos básicos y aromáticos, el método de Biuret basado en la reacción coloreada característica del enlace pepitico y el método del acido bicinconinico basado en la propiedad de las proteínas de reducir el ion cúprico a cuproso, que es un método mucho más sensible y fiable que los anteriores.
* Método de Lowry: El método de Lowry se basa en la reacción de las proteínas con el reactivo de Folindando un complejo coloreado. Este reactivo es una disolución de tungstato sódico y molibdato sódico en ácido fosfórico y ácido clorhídrico. El mecanismo del proceso es el siguiente: el Cu2+, en medio alcalino, forma un complejo con los enlaces peptídicos de las proteínas reduciéndose a Cu+. Este ion, así como los grupos R de los residuos de tirosina y triptófano de las proteínas, reaccionan con elreactivo de Folin, produciendo inicialmente un producto inestable, que se reduce para formar un compuesto coloreado. La intensidad del color depende de la cantidad presente en las proteínas de estos aminoácidos aromáticos y será proporcional a la concentración de proteínas en la disolución.

* Método de Bradford: se fundamenta en la fijación del colorante Azul de Coomassie a las proteínasdando lugar a un cambio en el color que puede ser medido en un espectrofotómetro. El método es extremadamente sensible, detectando cantidades de 1g o incluso inferiores. Su principal inconveniente radica en que el colorante no se fija por igual a todas las proteínas, con lo cual sus resultados no son homogéneos.

RESULTADOS.
Tabla No.1 Curva de calibración de hemoglobina. Método de Lowry
TuboNo. | Cantidad de proteína (g) | A590 | Serie ajustada por regresión lineal |
| | Serie A | Serie B | |
1 | 25 | 0.027 | 0.015 | 0.034 |
2 | 50 | 0.114 | 0.099 | 0.0915 |
3 | 75 | 0.146 | 0.164 | 0.149 |
4 | 100 | 0.219 | 0.187 | 0.2065 |
5 | 125 | 0.295 | 0.226 | 0.264 |

Tabla No. 2 Curva de calibración de hemoglobina. Método de Bradford
Tubo No. | Cantidad de proteína (g)| A590 | Serie ajustada por regresión lineal |
| | Serie A | Serie B | |
1 | 25 | 0.202 | 0.209 | 0.240 |
2 | 50 | 0.337 | 0.341 | 0.298 |
3 | 75 | 0.350 | 0.363 | 0.355 |
4 | 100 | 0.397 | 0.419 | 0.413 |
5 | 125 | 0.461 | 0.444 | 0.470 |

Grafica No 1. Curva de calibración de la hemoglobina por medio del método de Lowry

Grafica No. 2 Curva de calibración de la hemoglobinapor medio del método de Bradford.

Tabla No. 3 Replicas para el análisis estadístico. Método de Lowry
Tubo No. | A590 | Cantidad de proteína (g) |
1 | 0.142 | 71.95 |
2 | 0.179 | 88.04 |
3 | 0.135 | 68.91 |
4 | 0.156 | 78.04 |
5 | 0.143 | 72.39 |
6 | 0.133 | 68.04 |
7 | 0.132 | 67.60 |
8 | 0.128 | 65.86 |
9 | 0.129 | 66.30 |
10 | 0.144 | 72.82 |

Tabla No. 4 Replicas...