Protocolo clonación

Protocolo Clonación

1.- Purificacion fragmento de ADN desde Gel de Agarosa.

Realizar la electroforesis, luego, corte cuidadosamente el fragmento de agarosa y transfiéralo a un tubo de 1,5 - 2,0 mL previamente tarado. El peso de su fragmento en gramos corresponderá a un volumen. (Ejemplo 0.3 grs. equivalen a 300 μL.)

A.- Disolver el gel de Agarosa

.- Agregue 10 L de Membrane BindingSolution por cada 10 mg de Agarosa, agite por 1 minuto en vortex, e incube la mezcla a 50º- 65º C por 5-10 minutos, hasta que la agarosa este fundida.

B.- Unión del ADN

.- Insertar la mini-columna SV en un tubo de colección.

.- Transferir la mezcla agarosa fundida - Membrane Binding Solution a la Mini columna e incubar durante 1 minuto a temperatura ambiente.
.- Centrifugar lamini-columna junto con el tubo de colección a 12.000 rpm por un minuto. Descartar el líquido (algunas personas los guardan hasta cuantificar las muestras finales) y reinsertar la mini-columna en el tubo de colección.

C.- Lavado de la Muestra

.- Adicionar 700 L de Solucion de lavado (chequear que se le ha adicionado el Etanol), y centrifugar a 12.000 rpm por un minuto. Descartar el líquido yreinsertar la mini-columna en el tubo de colección.

.- Repetir el paso anterior, pero con 500 L de Solucion de lavado y centrifugar a 12.000 rpm por 5 minutos. Descartar el líquido y reinsertar la mini-columna en el tubo de colección.

.- Por último para secar la membrana centrifugar la minicolumna junto con el tubo de colección a 12.000 rpm por 1 minuto, con la tapa abierta para permitir laevaporación total del Etanol.

D.- Elusión de la Muestra.

.- Cuidadosamente, transfiera la mini-columna a un tubo de 1,5 mL.

.- Adicionar 25 L de agua nanopure a la mini-columna. Incubar por 1 minuto a temperatura ambiente y centrifugar a 12.000 rpm por 1 minuto.

.- Descartar la mini-columna y proceda a la cuantificación de su muestra.

Ligación:
Para el proceso de ligación se recomiendausar una relación molar de 1:1 o 1:3 de vector: DNA a ligar. Para calcular cuanto DNA deseamos utilizar el siguiente ejemplo ilustra la conversión de razones molares a razones de masa de un vector plasmidial de 3.0 Kb y un inserto de 0.5 Kb.

ng of vector × kb de Inserto × Razón molar inserto = ng de Inserto
kb size of vector vector

Ejemplo:

Cuanto ng de Inserto de0.5 Kb debe ser agregado a una ligación en la cual será usado 100 ng de un plásmido de 3.0 Kb, con una razón molar vector:inserto de 1:3?.

100 ng vector × 0.5 kb Inserto × 3 = 50 ng de Inserto
3 kb vector 1

Utilizar 25 ng de Vector pGEM-T easy (tamaño 3.015 Kb) y una razón molar de vector:Inserto de 1:3. Tamaño Inserto: 1.135 Kb.

Procedimiento:Buffer Ligasa 2X 5 L
Ligasa (3 U/L) 0.5 L
Inserto x L
PGEM-T 1 ul
H2O Completar a 10 L

-Dejar la reacción de ligación incubando por 12 horas a 4 ºC

Transformación:

- Tomar 4 μl del producto de ligación (plásmido recombinante) y adicionarlos a 50 μl de bacterias competentes Escherichia coli JM109. Agitar suavemente e incubar en hielo por 30 minutos.
- Luegoincube a 42º C durante 90 segundos la mezcla anterior (puede usar una termoplaca o un baño térmico).
- Deje en hielo por 3 minutos y luego agregue 400 L de medio de cultivo LB sin antibiótico e incube a 37º C durante 45 minutos a 220 rpm en agitador.
- Tome 100 L de medio de cultivo y agregar a Placas Agar LB + Ampicilina (100 g/mL) + X- gal (50 mg/mL).
- Opcionalmente, si la eficiencia detransformación es muy baja, puede realizar una breve centrifugación (spin down) de la mezcla inicial crecida en LB sin antibiótico, eliminar 400 L del sobrenadante y resuspender el pellet bacteriano en los 100 L restantes, para luego plaquear la mezcla completa en la placa de medio de cultivo con el agente seleccionador.
.- Incube durante 12-16 hr a 37ºC en estufa.

.- Seleccionar...