Purificación y caracterización electroforética de la proteína de unión a gh (ghbp) en suero humano y de pacientes con cáncer y embarazo: evidencia de una proteína de unión a prolactina (prlbp). (resumen de articulo de
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Publicado: 7 de marzo de 2011
Purificación y caracterización electroforética de la proteína de unión a GH (GHBP) en suero humano y de pacientes con cáncer y embarazo: evidencia de una proteína de unión a prolactina (PRLBP).
La Prolactina (PRL) y la hormona del crecimiento (GH) provienen de la misma familia de proteína HBP (hélix buncle proteins), estas proteínas son segregadas principalmente por células especializadas enla hipófisis; la PRL tiene la función de la regulación de las glándulas mamarias, la modulación de la respuesta inmune , la iniciación y mantenimiento de la lactancia entre otras. La GH tiene la función del crecimiento y desarrollo de vertebrados, específicamente el crecimiento longitudinal del hueso.
Los receptores de estas hormonas pertenecen a la superfamilia de los receptores de citocinas,poseen características estructurales en común, son activados por ligando y su actividad se regula por medio de la generación de formas solubles del receptor las cuales actúan como proteínas de unión, inhibiendo la unión del ligando a la membrana aunque también tienen una función agonista, incrementan la estabilidad del ligando, disminuye la degradación y aumentan la vida media del receptor. Elreceptor de PRL, tiene tres isoformas, idénticas en los dominios citoplasmático y extracelular; solo varía el tamaño del dominio citoplasmático este es más largo, Los receptores de GH tienen dos isoformas.
En la circulación la GH se encuentra enlazada a dos proteínas, una de alta y otra de baja afinidad; la de alta afinidad es el dominó extracelular del receptor, en la PRL hay una proteína enlazadaque corresponde al dominio extracelular del receptor aunque hay otra proteína de unión a PRL, pero por su peso y la secuencia de su estructura primaria no corresponde al receptor.
La GH y la PRL están relacionadas con el cáncer de mama y el embarazo, las pacientes con cáncer tienen concentraciones elevadas de GH y las celular cancerosas poseen numerosos receptores para PRL además de que la GHy PRL poseen un carácter mitogenico el cual las células cancerosas ulilizan para su beneficio. En el embarazo el crecimiento del embrión está ligado a una variante de la GH con variaciones estructurales mínimas y la PRL está ligada a la preparación de las glándulas mamarias para la lactancia.
Se analizaron tres clases de muestras: una de pacientes con cáncer de mama metastico, la segunda demujeres embarazadas, la tercera de mujeres sanas como control. Se utilizaron anticuerpos monoclonales contra el dominio extracelular de prolactina, anticuerpo monoclonal dirigido a un receptor de hormona del crecimiento, anticuerpos policlonales contra PRLR.
La detección de proteína de unión a PRL en suero se lleva a cabo por Western Blot, usando el anticuerpo monoclonal contra esta proteína, lasproteínas presentes en el suero se separaron electroforéticamente, en condiciones reductoras en poliacrilamida al 12% y en condiciones no reductoras en gel de 10%, luego se trasfirieron a la membrana de nitrocelulosa, se incubaron toda la noche a 4 °C en TBS (buffer tri-salino pH 7,4) luego la membrana se incubo con el anticuerpo en TTBS-BSA (TBS con Tween y BSA), una hora a temperatura ambiente,se lava con TTBS y después con el segundo anticuerpo, el de anti-IgG, se diluye 1:3000 y se encuba durante otra hora en mismas condiciones que el primer anticuerpo, se lava con TTBS y se revela la membrana por quimioluminiscencia.
Se realizaron ensayos de unión con rhGHBP (proteína de unión a GH recombinante humana) marcada radioactivamente con un buffer de unión, la proteína se incubo con laresina durante toda la noche a 4 °C, se centrifuga y se lava con PBS, se contaron en un contador de rayos gamma, se evaluaron concentraciones de 1, 10, 50% y volúmenes de 1, 10 y 100 mL de resina.
En base a las condiciones anteriores, se empleó cromatografía de afinidad con hGH-Sepharosa para la purificación de la proteína de unión a GH, las muestras de suero se incubaron en la resina (50%)...
La Prolactina (PRL) y la hormona del crecimiento (GH) provienen de la misma familia de proteína HBP (hélix buncle proteins), estas proteínas son segregadas principalmente por células especializadas enla hipófisis; la PRL tiene la función de la regulación de las glándulas mamarias, la modulación de la respuesta inmune , la iniciación y mantenimiento de la lactancia entre otras. La GH tiene la función del crecimiento y desarrollo de vertebrados, específicamente el crecimiento longitudinal del hueso.
Los receptores de estas hormonas pertenecen a la superfamilia de los receptores de citocinas,poseen características estructurales en común, son activados por ligando y su actividad se regula por medio de la generación de formas solubles del receptor las cuales actúan como proteínas de unión, inhibiendo la unión del ligando a la membrana aunque también tienen una función agonista, incrementan la estabilidad del ligando, disminuye la degradación y aumentan la vida media del receptor. Elreceptor de PRL, tiene tres isoformas, idénticas en los dominios citoplasmático y extracelular; solo varía el tamaño del dominio citoplasmático este es más largo, Los receptores de GH tienen dos isoformas.
En la circulación la GH se encuentra enlazada a dos proteínas, una de alta y otra de baja afinidad; la de alta afinidad es el dominó extracelular del receptor, en la PRL hay una proteína enlazadaque corresponde al dominio extracelular del receptor aunque hay otra proteína de unión a PRL, pero por su peso y la secuencia de su estructura primaria no corresponde al receptor.
La GH y la PRL están relacionadas con el cáncer de mama y el embarazo, las pacientes con cáncer tienen concentraciones elevadas de GH y las celular cancerosas poseen numerosos receptores para PRL además de que la GHy PRL poseen un carácter mitogenico el cual las células cancerosas ulilizan para su beneficio. En el embarazo el crecimiento del embrión está ligado a una variante de la GH con variaciones estructurales mínimas y la PRL está ligada a la preparación de las glándulas mamarias para la lactancia.
Se analizaron tres clases de muestras: una de pacientes con cáncer de mama metastico, la segunda demujeres embarazadas, la tercera de mujeres sanas como control. Se utilizaron anticuerpos monoclonales contra el dominio extracelular de prolactina, anticuerpo monoclonal dirigido a un receptor de hormona del crecimiento, anticuerpos policlonales contra PRLR.
La detección de proteína de unión a PRL en suero se lleva a cabo por Western Blot, usando el anticuerpo monoclonal contra esta proteína, lasproteínas presentes en el suero se separaron electroforéticamente, en condiciones reductoras en poliacrilamida al 12% y en condiciones no reductoras en gel de 10%, luego se trasfirieron a la membrana de nitrocelulosa, se incubaron toda la noche a 4 °C en TBS (buffer tri-salino pH 7,4) luego la membrana se incubo con el anticuerpo en TTBS-BSA (TBS con Tween y BSA), una hora a temperatura ambiente,se lava con TTBS y después con el segundo anticuerpo, el de anti-IgG, se diluye 1:3000 y se encuba durante otra hora en mismas condiciones que el primer anticuerpo, se lava con TTBS y se revela la membrana por quimioluminiscencia.
Se realizaron ensayos de unión con rhGHBP (proteína de unión a GH recombinante humana) marcada radioactivamente con un buffer de unión, la proteína se incubo con laresina durante toda la noche a 4 °C, se centrifuga y se lava con PBS, se contaron en un contador de rayos gamma, se evaluaron concentraciones de 1, 10, 50% y volúmenes de 1, 10 y 100 mL de resina.
En base a las condiciones anteriores, se empleó cromatografía de afinidad con hGH-Sepharosa para la purificación de la proteína de unión a GH, las muestras de suero se incubaron en la resina (50%)...
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