Reaccion pcr

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La PCR se basa en la repetición de tres procesos: (i) desnaturalización térmica del DNA; (ii) hibridación de cebadores (oligonucleótidos) específicos al DNA de cadena sencilla, y (iii) extensiónenzimática del DNA (Figura 1.8). El proceso se lleva a cabo en un bloque térmico denominado termociclador. En cada repetición se duplica la cantidad de DNA específico, así en una reacción típica de 30-40ciclos se generan 230-40 moléculas del DNA de interés (amplicones).
La temperatura de hibridación de los cebadores condiciona la especificidad del proceso; cuando no se conoce perfectamente lasecuencia del DNA de interés se puede utilizar una temperatura inferior a la óptima o también se pueden diseñar cebadores degenerados, en los que alguna de las posiciones puede estar ocupada por más de unnucleótido.

Figura 1.8
Esquema de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), mostrando 3 ciclos de amplificación; al finalizar el tercer ciclo se han generado 8 moléculas de DNA (23)
II.2.2.Materiales necesarios para la realización de una PCR y precauciones básicas
En el tubo de reacción hay que añadir un tampón de reacción adecuado, con una concentración de Mg2+ óptima para elfuncionamiento enzimático, los cebadores específicos (aprox. 0,4 µM de cada uno), los desoxinucleótidos trifosfato (dATP, dTTP, dGTP y dCTP; 200 µM de cada uno), la DNA polimerasa (1 U) y la muestra de DNA(entre 50-250 ng). El uso de DNA polimerasas termoestables permite que la enzima no se desnaturalice en la etapa de calentamiento.
Debido a la elevada sensibilidad de la PCR es esencial evitarcontaminaciones por DNA extraño; para ello se separan físicamente las zonas de preparación de muestras, preparación de reactivos, amplificación y detección; además, es conveniente el uso de puntas de pipetacon filtros, guantes desechables y pipetas diferenciadas para manipular muestras con DNA y reactivos. Es obligado el uso de controles positivos y negativos en cada tanda de reacciones.
II.2.3....
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