Reacción en cadena de la polimerasa (pcr)

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

INTRODUCCIÓN
Una de las técnicas principales empleadas en el laboratorio clínico es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Esta técnica fue desarrollada en 1985 por Kary Mullis; el PCR ha revolucionado la genética molecular, haciendo posible el estudio y análisis de una amplia gama de genes, que incluso pueden obtenerse a partir de un genomacompleto, como es el de los mamíferos donde pueden existir alrededor de cien mil genes.
La técnica de PCR se basa en la replicación del ADN en los organismos eucariontes y procariontes realizada por la ADN polimerasa. Esta enzima realiza la síntesis de una cadena complementaria de ADN en el sentido 5—3 usando un molde de cadena sencilla, pero a partir de una región de doble cadena. Para crearesta región doble cadena se usan los denominados iniciadores (cebadores o primers). Estos cebadores son secuencias de nucleótidos de cadena simple complementarias a la secuencias de nucleótidos que flanquean la secuencia de DNA.
La sensibilidad del diagnóstico de PCR es muy alta, ya que se producen varios millones de copias de la diana seleccionada. También puede ser muy alta la especificidad de lareacción debida a las secuencias mucleotídicas específicas formadas por los oligonucleótidos(cebadores).
PCR CLÁSICO O UNIVERSAL
Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual emplea ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, acontinuación, dejar que vuelvan a unirse a polimerasas para que vuelvan a duplicarlas. Puesto que las temperaturas del ciclo (95 °C en las fases de desnaturalización del ADN) suponen la inmediata desnaturalización de toda proteína, se emplean ADN polimerasas termoestables, extraídas de microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas, restrictivas para la mayoría de los seres vivos. Dichosmicroorganismos, generalmente arqueas, son: Thermus aquaticus (polimerasa Taq), Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus litoralis (Vent) y Thermus termophilus (Tth).
La región amplificada se caracteriza por cebadores; éstos son secuencias cortas, normalmente de 18 a 22 nucleótidos, que son reconocidos por la polimerasa permitiendo iniciar la reacción y que son complementarios con las regiones de ADNque flanquean la secuencia diana. Se hace uso de una solución tampón (buffer) que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa.
Repitiendo de 20 a 30 veces el régimen de ciclos de calentamiento, se obtendrá una cantidad de ADN diana copiado que será suficiente para operaciones ulteriores, tales como la detección, el clonado y la secuenciación. Si se parte de una moléculaúnica de ADN en la muestra inicial y en cada ciclo se duplica el número de moléculas, al final de los 30 ciclos, se obtendrá 230 moléculas idénticas.

Finalmente, en la tercera etapa se lleva a cabo la detección de los fragmentos amplificados en la PCR (amplicones) por electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio, o mediante hibridación con sondas específicas. En general todoeste proceso suele durar aproximadamente 24h.

Nota:
La cromatografía es la técnica que separa una mezcla de solutos basada en la velocidad de desplazamiento diferencial de los mismos que se establece al ser arrastrados por una fase móvil.
Los tamaños de los productos de PCR se determinan comparando los mismos, con marcadores que contienen fragmentos de ADN de tamaño conocido los cuales secorren en el gel junto a los productos de PCR.

PCR TIEMPO REAL

La PCR en tiempo real o PCR cuantitativa es una variante de la PCR que permite cuantificar además de detectar y amplificar secuencias de ADN.
Fundamento: En PCR a tiempo real, los procesos de amplificación y detección se producen de manera simultánea en el mismo vial cerrado, sin necesidad de ninguna acción posterior. Además,...