Western blot

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Western Blot

En la técnica de western blot las proteínas son separadas electroforeticamente en geles de poliacrilamida, para luego ser transferidas a una membrana y posteriormente serdetectadas.
Esta técnica también llamada “inmunoblotting” debido a que se utilizan anticuerpos para detectar el antígeno o los antígenos específicos de interés) fue descrita por primera vez por Towbin et al.en 1979 y en la actualidad es una técnica de rutina para realizar análisis de proteínas. La especificidad de la unión antígeno –anticuerpo permite la detección de una única proteína dentro de unamezcla compleja de otras proteínas.

Todo procedimiento de 'blotting' consta de 5 etapas:

Transferencia: Inmobilización de proteínas sobre la membrana mediante transferencia electroforética. Elcampo eléctrico actúa de forma perpendicular a la membrana, la que es generalmente de nitrocelulosa o PVDF y al gel, desde un polo (-) a uno (+). Este procedimiento necesita de buffer que permitan laconductividad eléctrica y la fijación de las proteínas. Para comprobar la efectividad de la transferencia, las proteínas presentes en la membrana son teñidas débilmente con rojo Ponceau.[pic]
Figura 1: Esquema transferencia de proteínas desde gel a membrana.

Bloqueo: Saturación de todos los lugares de unión de proteínas de la membrana no ocupados paraevitar la unión no específica de anticuerpos, que son proteínas. Para este paso se utiliza leche descremada o suero de albúmina bovino (BSA).

Unión del primer anticuerpo: Incubación membrana conanticuerpo primarios contra la/s proteína/s de interés.

Unión con anticuerpos secundarios: Se utiliza un segundo anticuerpo que se liga al primero. El segundo anticuerpo o reactivo se encuentraunido a enzimas u otros marcadores que actúan dando un precipitado cromogénico o fluoregénico en la membrana.

Los tipos de marcaje son diversos y variados y entre ellos se encuentran la biotina,...
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