Purificacion De Una Enzima

Práctica 3 – Purificación de una enzima: La lisozima de huevo.

1. Introducción:

Se conocen como lisozimas a un grupo de enzimas conocidas por catalizar la hidrólisis de los enlaces glicosídicos β (1→4) de los polisacáridos de la pared celular bacteriana. Conformacionalmente, son proteínas globulares formadas por sólo una cadena polipeptídica y con un peso molecular comprendido entre los14 y 30 kDa. Su gran estabilidad viene marcada por la por la presencia de cuatro puentes disulfuro y hay que destacar que fue la primera proteína de la que se dispuso un modelo tridimensional, y a su vez, la primera de la que se obtuvo el mecanismo detallado de su acción.

2. Objetivos comunes:

* Purificación de la enzima lisozima (a partir de clara de huevo y mediante lacromatografía de intercambio iónico).
* Medición de su actividad enzimática.
* Determinación proteica mediante el uso del método de Lowry.

PARTE A – PURIFICACIÓN DE LISOZIMA

1. Fundamento:

Para la realización de esta parte de la práctica se utilizará la cromatografía de intercambio iónico, basada en las propiedades ácido-base de las proteínas (a pH menor de su pI, tendrá carga positiva, ycarga negativa a mayor valor de su pH en su pI). Así, en el primer caso, se unirá a una resina con carga negativa como es la carboximetil-celulosa o CM-celulosa, y en el segundo caso, a una resina con carga positiva como la dietilaminoetil-celulosa o DEAE-celulosa.
Una vez que la proteína está unida a una resina, pueden darse dos procesos de elución:
* Por variación de pH del medio hastaalcanzar el pI.
* Por un gradiente iónico, añadiendo el contraión correspondiente.

2. Material utilizado:

* Clara de huevo de gallina (ya separada).
* Tampón A: glicina/NaOH 100 mM, pH 10.
* Tampón B: glicina/NaOH 100 mM, pH 10, contenido 0.6 M NaCl.
* Carboximetil-celulosa (CM) (ya activada).
* Agua destilada.

3. Instrumentos y máquinas utilizadas:

* Tubosde centrífuga y tapas
* Frascos para depositar las diferentes fracciones.
* Centrifuga
* Balanza
* Probeta
* Pipetas de diferentes sensibilidades
* Puntas de las pipetas

4. Resumen del procedimiento:

* En primer lugar, tomamos 10 mL de la muestra de clara de huevo (que ya se nos proporcionó separada de la yema) y lo depositamos en tubo de centrifuga. El resto declara de huevo lo separamos, lo depositamos en un frasco y lo nombramos como F0.
* Añadimos al tubo de centrífuga 4 mL de CM-celulosa (ya activada) y agitamos como movimientos suaves durante 15 minutos para conseguir la adsorción de la lisozima a la resina.
* Una vez agitado, y antes de llevarlo a la centrífuga, tenemos que conseguir otro tubo de centrífuga con el mismo peso para que estano se desequilibre; Para ello, llenamos un tubo con agua destilada y ponemos ambos en una balanza hasta conseguir el equilibrio (retirando o añadiendo agua destilada al segundo tubo).
* Realizado el paso anterior, llevamos ambos tubos a la centrífuga, donde estarán 3 minutos a 1000 rpm.
* El siguiente paso consiste en guardar el sobrenadante en otro frasco, que será denominado F1, trashaber medido su volumen con una probeta. El precipitado le dejamos en el tubo.
* Añadimos 10 mL de tampón A al precipitado y tras agitar un par de minutos, lo llevamos de nuevo a la centrífuga en las mismas condiciones de las que anteriormente hablamos. Una vez fuera, repetimos los pasos anteriores: recogemos el sobrenadante en un frasco (F2) tras haber medido su volumen con una probeta ydejamos en el tubo el precipitado.
* Como paso final, a modo de elución, resuspendemos la CM-celulosa del tubo de precipitado con 3 mL de tampón B y agitamos suavemente durante 10 minutos. Hecho esto, centrifugamos, recogemos la elución y la guardamos con el nombre de F3 (lisozima purificada).

PARTE B – MEDIDA DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

1. Fundamento:

Para medir la actividad lisozima,...