Cinetica enzimatica

INFORME DE LABORATORIO N°2
CINÉTICA ENZIMÁTICA
OBJETIVOS
Objetivo general
* Analizar algunos factores fisicoquímicos que inciden sobre la actividad enzimática de la catalasa.

Objetivos específicos
* Determinar el pH óptimo de la catalasa.
* Determinar el efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad de reacción.
* Representar gráficamente la actividad enzimáticade la catalasa de acuerdo con el modelo de Michaelis-Menten.
* Transformar el gráfico de Michaelis-Menten a la representación del modelo de inversos de Lineweaver-Burk.
* Determinar la Km a partir de los gráficos obtenidos con los objetivos 3 y 4.

MATERIALES Y EQUIPO
* 14 matraces volumétricos de 25 ml (frascos compoteros)
* Gradilla
* Pipetas graduadas de 1, 5 y 10 ml
*Micropipeta de 20 µl
* Matraz Erlenmeyer de 125 ml
* Probeta de 25 ml
* Jeringa de 3 ml
* Torniquete
* Torundas con alcohol etílico
* Tiras reactivas para medir pH
* Vasos de precipitado de 250 ml
* Pipetor
* Recibiente con hielo
SOLUCIONES Y REACTIVOS
* H2SO4 2N que contenga 1 mg/ml de MnSO4
* KMnO4 0.05N
* Soluciones de sustrato: H2O2 al 0.24%acidulada a pH 5, 7 Y 9.
* Solución de catalasa (1:1000)

Cinética enzimática
Los auxiliares realizaron la preparación de la solución de la catalasa al colocar 25 ml de agua destilada (fría) en un matraz de 125 ml y agregaron 25 µl de sangre. La mezcla se mantuvo en baño de hielo como se muestra en las siguientes imagenes:

Se prepararon 14 matraces por cada pH de acuerdo a los cuadrosdados. Dejamos reposar por 5 minutos y luego añadimos una cantidad igual para todos de 5 ml de H2SO4 2N y luego si titulamos cada matraz con Permanganato de Potasio.

Además registramos los mililitros de KMnO4 utilizados para la titulación. Dejamos en claro que nuestro grupo realizó el experimento a pH 7.0.

RESULTADOS
Experimento N°1
Actividad enzimática a pH 5.0
Matraz | H2O2 pH 5.0 (ml) |H2O (ml) | Catalasa (ml) | Reposo 5 min | H2SO4 2N (ml) | A titular (ml de KMnO4 0.05N) | X meq de H2O2 | Y meq de H2O2 descompuesto |
1 | 0.5 | 7.5 | ---  | | 5 | 0.4 | 0.02 | 0.0 |
2 | 0.5 | 7.5 | 0.5 | | 5 | 0.3 |  0.015 | 0.1 |
3 | 1 | 7 | ---  | | 5 | 0.5 |  0.025 | 0.0 |
4 | 1 | 7 | 0.5 | | 5 | 0.3 |  0.015 | 0.2 |
5 | 2 | 6 | ---  | | 5 | 1.2 |  0.06 | 0.0 |
6 | 2 | 6 | 0.5| | 5 | 0.7 |  0.035 | 0.5 |
7 | 4 | 4 | ---  | | 5 | 2.5 |  0.125 | 0.0 |
8 | 4 | 4 | 0.5 | | 5 | 1.4 |  0.07 | 1.1 |
9 | 5 | 3 | ---  | | 5 | 2.9 |  0.145 | 0.0 |
10 | 5 | 3 | 0.5 | | 5 | 1.9 |  0.095 | 1.0 |
11 | 6 | 2 | ---  | | 5 | 4.0 |  0.2 | 0.0 |
12 | 6 | 2 | 0.5 | | 5 | 2.5 |  0.125 | 1.5 |
13 | 8 | ---  | ---  | | 5 | 6.1 | 0.305  | 0.0 |
14 | 8 |  ---  | 0.5 || 5 | 4.9 | 0.245 | 1.2 |

Matraz con catalasa | Concentración del sustrato | Velocidad obtenida meq/min |
2 | 0.015 | 0.02 |
4 | 0.015 | 0.04 |
6 | 0.035 | 0.1 |
8 | 0.07 | 0.22 |
10 | 0.095 | 0.2 |
12 | 0.125 | 0.3 |
14 | 0.245 | 0.24 |

Experimento N°2
Actividad enzimática a pH 7.0
Matraz | H2O2 pH 7.0 (ml) | H2O (ml) | Catalasa (ml) | Reposo 5 min | H2SO4 2N (ml) | Atitular (ml de KMnO4 0.05N) | X meq de H2O2 | Y meq de H2O2 descompuesto |
1 | 0.5 | 7.5 | ---  | | 5 | 0.3 | 0.015  |  0.0 |
2 | 0.5 | 7.5 | 0.5 | | 5 | 0.3 |  0.015 |  0.0 |
3 | 1 | 7 | ---  | | 5 | 0.8 |  0.04 |  0.0 |
4 | 1 | 7 | 0.5 | | 5 | 0.3 |  0.015 |  0.5 |
5 | 2 | 6 | ---  | | 5 | 1.2 |  0.06 |  0.0 |
6 | 2 | 6 | 0.5 | | 5 | 0.5 |  0.025 |  0.7 |
7 | 4 | 4 | ---  | | 5| 2.6 |  0.13 |  0.0 |
8 | 4 | 4 | 0.5 | | 5 | 1.1 |  0.055 |  1.5 |
9 | 5 | 3 | ---  | | 5 | 3.4 |  0.17 |  0.0 |
10 | 5 | 3 | 0.5 | | 5 | 1.7 |  0.085 |  1.7 |
11 | 6 | 2 | ---  | | 5 | 5.8 |  0.29 |  0.0 |
12 | 6 | 2 | 0.5 | | 5 | 1.9 |  0.095 |  3.9 |
13 | 8 | ---  | ---  | | 5 | 5.1 |  0.255 |  0.0 |
14 | 8 |  ---  | 0.5 | | 5 | 2.8 |  0.14 |  2.3 |

Matraz con...