Fraccionamiento

Universidad Tecnológica Metropolitana
Departamento de Biotecnología

Laboratorio nº 1 de Bioquímica
Fraccionamiento celular por centrifugación diferencial y en gradiente de sucrosa.
Integrantes:

Introducción
El objetivo de este laboratorio es poder descubrir mediante centrifugación los componentes de la célula. Para poder encontrar a los componentes, tenemos que cumplir con diferentesprocesos. Abriremos las células vegetales en la Homogenización, luego separaremos los componentes de las células en el fraccionamiento. Todo esto acompañado de centrifugaciones diferenciales, que varían en su tiempo y en su velocidad.
La más importante es la centrifugación en gradiente de sucrosa, la cual es a una velocidad mayor y por mas tiempo, esta nos permitirá utilizar este ultimo Pellet enlas fases de sucrosa dispuestas por densidad, las cuales se moverán hasta llegar a que la densidad de ella y la del medio sean la misma, esto nos servirá para poder encontrar por medio del refractómetro la densidad de los organelos y poder encontrar su tipo.

Objetivos

Aplicar los principios de la centrifugación en el fraccionamiento celular en una gradiente de sucrosa y comprobar lapresencia de organelos en las distintas fracciones mediante microscopia de contraste de fases. Medir concentración de sucrosa por refractómetro en cada fracción, así determinar densidad e identificar algún organelo.

Materiales

- Hojas frescas y tiernas de espinacas.
- Soluciones de sucrosa en 0,01 M EDTA, Ph 7,5: 33%, 44%, 50%, 57%, 60% (p/v).
- Medio para homogenizar:
1. 0,4 M Sucrosa2. 0,165 M Tris-HCl buffer, pH 7,5
3. 0,01 M KCl
4. 0,01 M MgCl2
5. 0,01 M EDTA ajustado a pH 7,5
6. 0.01 M ditiotreitol

- Cuchillo o tijeras; mortero, gasa para filtrar
- Ultracentrifuga beckman con rotor SW 28.1 y Centrifuga Sigma.
- Microscopio contraste de fases o de campo claro.
- Refractómetros de 0 a 30% y de 28 a 60%

Procedimiento

1-Como primer paso se deben pesar y cortar 25g de hojas frescas de espinacas descartando las nervaduras. Molerlas en un mortero en baño de hielo por 30 seg. Luego se agregan lentamente 50 ml de medio homogenizante frió. Rápidamente se filtra a través de una doble capa de gasa, se transfiere alícuotas de 10 a 20 ml del filtrado a tubos de centrifuga y se lleva a centrifuga Sigma centrifugaa 4ºC, 2.500 rpm por 10 minutos así se células enteras y otros restos de tejidos vegetales. Mientras transcurre la centrifugación:

a) Llevar una pequeña parte con un corte vertical de hoja de espinacas y reconocer componentes celulares en el microscopio

b) Preparar 2 tubos de centrifuga de 17 ml (del rotor SW 28.1 Beckman) para la gradiente de sucrosa. Se colocan lentamente y enorden las concentraciones de sucrosa, escurriendo por las paredes del tubo. La disposición es:
1,5 ml de sucrosa 60% ; 3,0 ml de sucrosa 57% ; 4,5 ml de sucrosa 50% ; 4,5 ml de sucrosa 44% ; 1,5 ml de sucrosa 33%

2- Luego retirar el sobrenadante de la primera centrifugación en dos tubos de centrifuga limpios y fríos, volver a centrifugar a 4ºC por 30 minutos 12.000 rpm. Mientras seespera, debemos tomar una pequeña muestra de Pellet, obsérvelo en un microscopio y lo dibujamos.
Después de esta segunda centrifugación, guardar el sobrenadante en dos tubos de centrifuga en frió para ser analizado posteriormente y el Pellet suspenderlo en 6 ml de medio homogenizante.

3- Cuidadosamente colocar 1 ml de Pellet resuspendido sobre la gradiente de sucrosa de los dos tubos que habrápreparado previamente. Balancear el peso de ambos tubos agregando medio homogenizante si fuese necesario, de manera de obtener el mismo peso en ambos tubos. Centrifugar los tubos a 4ºC por 2 horas a 25.000 rpm en un rotor SW 28.1 en la ultracentrifuga Beckman.

4- Completada la centrifugación, observar las zonas formadas y fraccionar el contenido de tubo en 11 porciones de 1,5 ml cada...